Gram négatif
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Les bactéries à gram négatif sont mises en évidence par une technique de coloration appelée coloration de Gram. Les bactéries à gram négatif apparaissent alors roses au microscope. La technique de coloration repose sur les caractéristiques membranaires et de paroi de la bactérie. La coloration de Gram est un facteur déterminant dans la taxonomie (classification) bactérienne.
Sommaire |
[] Principe de coloration des Gram négatifs
Après fixation des bactéries sur une lame (deux méthodes possibles : fixation à l'éthanol à 90° ou par passage de la lame dans la flamme, dite frottis) :
- La lame est plongée dans un premier colorant : le violet de gentiane. Le violet de gentiane est un colorant puissant, (toxique et cancérigène). Il va traverser les parois et membranes des bactéries et se fixer dans leurs cytoplasmes. Ainsi à cette étape toute les cellules sont colorées en violet.
- La lame est ensuite traitée au lugol (diiode) en solution qui sert de mordant : il va renforcer le violet de gentiane contenu dans le cytoplasme des bactéries.
- On chasse ensuite le violet avec une solution d'éthanol a 90°. Cette étape est cruciale car elle détermine quelle bactérie est gram négatif et quelle bactérie est gram positif. Le princicipe est le suivant : les bactéries gram négatif possédent une paroi pauvre en peptidoglycane, composant qui empêche l'alcool d'emporter le violet de gentiane celui-ci restant dans le cytoplasme. la bactérie est donc décolorée (pour plus d'information, voir les caractèristiques des bactéries gram négatif).
- La lame après avoir été rincée et plongée brièvement dans un deuxième colorant, la fuschine. Ce colorant traverse toutes les parois et membranes et va colorer en rose toutes les bactéries qui ont été décolorées durant l'étape précédente ; les bactériee gram positif étant colorées en violet (plus sombre) n'apparaîtront pas rose (plus clair).
La lame est ensuite récupérée, rincée et séchée, puis observée au microscope optique généralement à l'objectif x100 + huile à immersion. Les bactéries gram négatif apparaîtront en rose. L'observation de leurs couleurs est généralemment accompagnée de descriptions structurelles (ex. bacille ou coque).
[] Caractéristiques des bactéries gram négatif
[] Description de l'enveloppe
Les bactéries gram négatif ont une structure qui s'organise en trois grandes parties : (de l'extérieur vers l'intérieur)
- La membrane externe
- L'espace périplasmique et peptidoglycane
- La membrane plasmique
La membrane externe est en contact direct avec le milieu extérieur. Elle est principalement composée de phospholipides organisés en bicouche (partie hydrophile à l'extérieur et partie lipophile à l'intérieur) mais contient aussi de nombreuses protéines intrinsèques, notamment les protéines de transports appelées porines. Beaucoup de gram négatif (ex. Salmonella) possédent aussi un composé non protidique appelé lipopolysaccharide ou LPS ; ce composé peu immunogène, dont le pouvoir pathogène (Lipide A) est inclu dans la membrane externe, s'active lors de la lyse de la bactérie. La membrane externe est reliée au peptidoglycane par la lipoprotéine de Braun.
L'espace périplasmique est un espace de stockage d'enzymes, de nutriments... Il a beaucoup d'autres fonctions notamment dans certaines étapes de la synthèse de protéines et dans le métabolisme. Il se situe entre la membrane externe et la membrane plasmique et il contient une couche de peptidoglycane. La couche de peptidoglycane (appelé aussi muréine) est relativement mince chez les gram négatifs contrairement aux gram positifs.
La membrane plasmique est semblable à la membrane externe (excepté le LPS). Elle possède des proteines poreuses aboutissant dans l'espace périplasmique (synthèse de protéine). La membrane plasmique contient de nombreux autres complexes protéiques d'une importance vitale pour la bactérie (comme l'ATP synthase) qui ont des rôles prépondérants dans le métabolisme bactérien.
[] Exemples de bactéries Gram négatifs
- Famille des Enterobacteriaceae :
- Genre Salmonella
- Espèce Escherichia coli
- Espèce Yersinia pestis (responsable de la Peste)
- Famille des Vibrionaceae :
- Espèce Vibrio cholerae (responsable du choléra)
[] Recherche de l'oxydase
[] But
Le caractère oxydase est un critère qui peu être important dans la recherche de l'espèce bactérienne étudiée.
[] Réalisation
Déposez un papier filtre impregné de PDA ou de chlorydrate sur une lamelle propre et sèche, prélevez quelques colonies solides à l'aide de pipette pasteur fermée puis déposez ces colonies sur la partie humide de votre papier filtre
[] Observations et conclusion
Patientez 30 secondes et si une tâche violette apparait, la bactérie sera dite oxydase+, sinon elle sera dite oxydase-
[] Orientation possible de souche Gram négatif
Après avoir réalisé le test oxydase, vous pourrez choisir la galerie de milieu d'idendification de votre souche:
- Si elle est oxydase -, vous pourrez vous orienter vers la famille des entero-bacteriaceae (ou entero bacteries)
- Si elle est oxydase +, vous pourrez vous orienter vers les familles vibrionaceae ou pseudomonas
[] Voir aussi
- Les mycobactéries : une exception car non colorable par la méthode de Gram car Acido-alcoolo-résistants.
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